Реферат Курсовая Конспект
Электрофоретические методы в отсутствие поддерживающей среды: свободный электрофорез - раздел Энергетика, Лекция 7. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ Свободный Электрофорез Различные Методы Электрофореза Пока Ши...
|
Свободный электрофорез
Различные методы электрофореза пока широко не используются в качестве зонда структуры. Причина проста: сложные взаимодействия между ионами, растворителями, солями, гелем (если последний присутствует) и внешнее электрическое поле усложняют интерпретацию электрофоретической подвижности. Однако при отсутствии геля, в методе электрофореза в растворе, который мы в дальнейшем будем называть свободным электрофорезом (FFE – от англ. Free-flow electrophoresis), интерпретация данных может быть более однозначной. Развитие аналитического электрофореза в мембранной геометрии и капиллярного электрофореза показало, что метод FFE может эффективно применяться для исследований относительно больших и сильно заряженных биологических макромолекул. FFE также является эффективным методом для разделения макромолекул в потоке. В этом методе переносящий вещество буферный раствор заключается между двумя вертикальными пластинами, находящимися на близком расстоянии друг от друга. Электрическое поле прилагается перпендикулярно переносящему потоку, в то время как раствор образца вводится непрерывно в переносящий буфер в виде узкой полосы. Компоненты образца впоследствии разделяются в электрическом поле в поперечном направлении в соответствии с их электрофоретической подвижностью, и затем отбираются на выходе (рис. 26.2).
Рис 26.2. Принцип работы метода FFE. Объяснения в тексте
Этот метод очень хорош для работы с белками и клетками, поскольку в нем не используются органические растворители, высокие концентрации солей или поддерживающие среды.
Метод движущейся границы
В электрофоретическом эксперименте на частицу действуют четыре силы (рис. 26.3). Первая это электростатическая сила F1 = Q E.Вторая – гидродинамическая сила трения F2 = fпост u, где fпост – коэффициент поступательного трения, а u скорость частицы. Третья сила F3 возникает в результате тенденции макроионов быть окруженными противоионами, в результате чего поток противоионов движется в направлении, противоположном их движению. По этой причине макроионы всегда движутся против потока так, что их скорость по отношению к их непосредственному окружению будет выше, чем таковая в лабораторной системе координат. И наконец, четвертая сила, F4, возникает при искажении ионной атмосферы (эффект асимметрии поля). Эта сила обусловлена дипольным моментом, который возникает при перераспределении противоионов под воздействием внешнего электрического поля.
|
|
|
|
Рис. 26.3. Четыре силы, действующие на молекулу в опыте по электрофоретической подвижности
В результате общий заряд Q макромолекулы можно определить из ее подвижности под действием всех четырех сил:
F2 + F3 +F4 = F1 = f u = Q/E (26.8)
Тогда подвижность равна: μ = u /E = Q/fэфф , где fэфф – эффективный коэффициент трения, производимый силами F2, F3 и F4.
Электрофоретический метод движущейся границы наиболее часто применяется для определения общего заряда на ДНК олигонуклеотидах. Скорость перемещения границы фиксируется аппаратурой, приспособленной для измерения аналитического электрофореза и диффузии в реальном режиме времени. Рисунок 26.4 показывает профиль интенсивности поглощения в ячейке при движении границы ДНК олигомеров (pd(A)20·pd(T)20.
Рис. 26.4. Профиль интенсивности в ячейке, показывающей границу олигомера DNA(pd(A)20 pd(T)20, C = 250 мкг·см-3 в 100 мM KCl, 20 мM Tris, pH 8.0, движущуюся слева направо. Положение мембран, M, обозначено с каждой стороны ячейки. Данные приведены для профилей, полученных через 20, 80, и 150 сек после приложения поля (E = 3.0 В·cм-1)
Из данных, представленных на этом рисунке вычисленная электрофоретическая подвижность μ для (pd(A)20 pd(T)20 оказалась равной 2.99 10-4 cм2·В-1·сек-1 при 20oC.
Метод стационарного электрофореза
В противоположность свободному электрофорезу, когда граница перемещается свободно, в стационарном электрофорезе макроионы захватываются небольшими камерами, поверхность и дно которых закрыты полупроницаемыми мембранами. Электрическое поле прилагается вдоль полости камеры, так что макроионы скапливаются против одной из мембран. Диффузия образует поток макроионов в направлении противоположном направлению электрического поля. При наступлении стационарного состояния, эти два потока выравниваются в каждой точке и при этом устанавливается градиент концентрации. Таким образом, в стационарном электрофорезе потоки, также как и силы сбалансированы. Распределение концентрации макроионов при этом будет описываться уравнением:
C = C0 exp [σ(x – x0)] (26.13)
где C0 – концентрация в точке x0 и экспонента σ = QE/fэффDэфф включает Dэфф – коэффициент диффузии при наличии электрического поля. Теперь Q = σfэффDэфф/E. Предполагая, что уравнение fэфф = kT/Dэфф применимо для этого случая, получаем:
Q = σ kT/E (26.14)
Уравнение 26.14 обеспечивает простой путь определения эффективного заряда молекулы непосредственно из экспериментальных измерений величин σ, E, и T, в противоположность измерениям подвижности, которые требуют знания fэфф или Dэфф.
Стационарный концентрационный градиент препарата олигомеров ДНК (pd(A)20 pd(T)20 показан на рисунке 26.5 а. Коэффициент диффузии в отсутствие электрического поля можно получить из значения релаксации равновесного концентрационного градиента (рис. 26.5 б).
Рис. 26.5.а) Зависимость оптического поглощения А260от расстояния х для олигомеров ДНК (pd(A)20 pd(T)20 в буфере, содержащем 100 мM KCl, 20 мM Трис-HCl, pH 8.0, после выключения поля. Начальный стационарный градиент (пунктирная линия) был сформирован приложением поля силой 0.12 В·см-1 в течение более 24 часов. б) Определение коэффициента диффузии для олигомеров ДНК (pd(A)20 pd(T)20. Наклон линии ln(A2/3 – A1/3) как функция времени пропорционален π2D·L-2, где A2/3 и A1/3 есть значения оптической плотности при уровнях последней, равной 2/3 и 1/3, соответственно
Вычисленное из этих данных значение D оказалось равным 9.6×10-7 cм2·сек-1, что находится в хорошем согласии с таковым (10.86×10-7cм2∙сек-1), полученным методом динамического рассеяния. Если предположить, что уравнение Эйнштейна fD = kT действительно также и для «одетых» макроионов, находящихся в электрическом поле, то методом стационарного электрофореза можно оценить эффективный электрический заряд макромолекулы. Значение Q, полученное из уравнения 26.14, дает отношение эффективного заряда к формальному заряду Q/40 (для двойной спирали ДНК длиной 20 пар оснований) очень близкое к предсказанному (0.12), в присутствии одновалентных солей без учета поправки на конечную длину макроиона.
– Конец работы –
Эта тема принадлежит разделу:
Электрофоретические эксперименты Другое направление объединяло различные электрофоретические методы в... Разделение по массе и заряду двумерный гель электрофорез... Двумерный электрофорезобъединяет два метода изоэлектрофокусировку IEF с SDS электрофорезом в полиакриламидном геле...
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Электрофоретические методы в отсутствие поддерживающей среды: свободный электрофорез
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Твитнуть |
Новости и инфо для студентов