Общие принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета

Общие принципы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета. Современная иммунология исключительно многолика, а сферы применения иммунологических знаний и методов беспредельно разнообразны.

Они используются практически во всех разделах биологии, ветеринарии и медицины от фундаментальных молекулярно-биологических исследовании до медико-генетического консультирования и множества других сугубо практических процедур, осуществляемых растениеводами, животноводами и медиками. И, тем не менее, особенно важным в социальном отношении и методически наиболее передовым продолжает быть тот старейший и неуклонно развивающейся раздел иммунологии, успехами которого обеспечивается развитие теории и осуществление практики противоэпидемической работы диагностики, профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

А методы иммунологической экспресс-диагностики имеют ключевое значение для эффективного решения названных проблем и осуществления всех соответствующих противоэпидемических мероприятий. Следующие ниже материалы и посвящены именно этому разделу прикладной иммунологии, его состоянию и перспективам развития.

Важнейшей предпосылкой эффективности любых противоэпидемических мероприятий является своевременное прогнозирование и обнаружение моментов активизации тех экологических и социально-экологических взаимодействий, которые составляют существо эпидемических процессов.

Исключительное разнообразие, свойственное последним и требующее дифференциации противоэпидемических мероприятий, обусловлено не только самобытностью каждой из существующего множества инфекционных болезней. Очень большое значение имеет в этом отношении фундаментальное явление гетерогенности популяций, входящих в состав соответствующих экологических и социально-экологических систем микроб жертва. Вариабильность этих весьма сложных биосоциальных факторов и условий в очень большой мере влияет на специфику того или иного этапа существования каждого эпидемического процесса. И своевременное распознавание этих особенностей, осуществляемое, как правило, с использованием иммунологических методов, обеспечивает ту дифференциацию противоэпидемических мероприятий, благодаря которой достигается надлежащее сочетание их эффективности и оправданности.

Активизация эпидемических процессов определяется, прежде всего, изменением соотношений между двумя основными параметрами экологических систем микроб жертва, а именно между болезнетворными потенциями возбудителей соответствующих инфекций и иммунологическим статусом угрожаемых контингентов в целом и каждого из их членов в отдельности.

Соотношения между этими параметрами определяют сроки и интенсивность активизации эпидемических процессов, а следовательно объем и характер противоэпидемических мероприятий. Состояние же этих параметров и соотношения между ними характеризуются главным образом с помощью иммуно-диагностических методов, позволяющих оценивать состояния инфицированности и иммунности, как индивидуумов, так и коллективов.

Вполне понятно, что наибольшую ценность имеют экспрессные методы иммунодиагностики. Иммунологические методы экспресс-диагностики состояний инфекции и иммунитета в некоторых отношениях принципиально различны, но во многих других аспектах они являются практически едиными. Методы экспресс-диагностики инфекционных заболеваний до недавнего времени развивались главным образом на основе классических схем микробиологического анализа, который сводится к выделению в чистой культуре возбудителя и последующей его идентификации по биохимическим, тинкториальным, антигенным и другим характерным свойствам.

Многоэтапность этих анализов обусловливает их длительность и практически исключает экспрессность, удовлетворяющую эпидемиологическую и клиническую практику. Длительность микробиологического анализа составляет, как минимум, несколько дней. Экспресс-индикация это своеобразная разведка большой армии лабораторной диагностики. Она находится на переднем крае научного поиска новых, простых, экономичных, быстрых методов индикации микробов, часть из которых в дальнейшем идет на вооружение лабораторной практики и благодаря этому последняя все время совершенствуется.

Основные объективные требования к экспрессным методам диагностики инфекционных заболеваний сводятся к следующему 1. получение результатов анализа в максимально короткие сроки часы, идеально минуты 2. возможность проведения и завершения анализа без выделения искомого микроорганизма в чистой культуре, при использовании только нативного материала, в крайнем случае с привлечением элективных биосред для быстрого накопления возбудителей 3. бесспорно высокая специфичность и высокая чувствительность, как предпосылки надлежащей достоверности анализа 4. высокая производительность, простота, доступность и воспроизводимость анализов.

Эти требования в равной мере приложимы и к методам экспрессной диагностики состояний иммунитета.

Предпочтительность использования того или иного из существующих методов экспресс- диагностики зависит от многих конкретных условий. Однако наиболее желательным является параллельное использование 2 3 методов. Такой подход значительно увеличивает надежность получаемого результата. На ближайшие годы наиболее перспективными следующие направления развития экспресс-индикации микроорганизмов. 1. Энзимоиндикационное направление, связанное с экспресс-индикацией биохимических свойств и определением ферментативного спектра микробов.

По-прежнему сохранят свою значимость исследования по разработке политропных полисубстратных питательных сред. В нашей стране были разработаны оригинальные политропные среды и их комбинации, которые с успехом применяются в лабораторной практике. При создании сложных поликомпонентных питательных систем необходимо исходить из различных биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов.

Для лучшего проявления жизнедеятельности и биохимической активности патогенных и других микробов в средах необходимо создавать оптимальные условия для их роста и размножения и одновременно вводить ферментируемые субстраты углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты и др. с наиболее чувствительными индикаторами, которые быстро бы регистрировали их ферментацию. В результате применения оптимальных полисубстратных сред производится выделение и накопление чистой культуры микробов с одновременным определением их биохимических признаков.

Перспективным следует рассматривать развитие энзимоиндикационных методов, в которых субстрат с индикатором отделен от питательной среды и фиксирован на специальном носителе. В нашей стране разработаны углеводно-бумажные диски с защитной пленкой бумажные реагенты для определения дезаминаз у микробов и их аналоги БИС бумажно-индикаторные системы, углеводно-бумажные поплавки, углеводно-полимерные пленки. Все эти препараты являются весьма перспективными, они позволяют в течение кратчайшего срока 3 5 ч, используя общепринятые питательные среды и лабораторную посуду, определять ферментативную активность различных видов микроорганизмов.

Автономный препарат карандаш-фермент, не имеющий аналогов ни у нас, ни за рубежом, позволяет без применения питательных сред непосредственно на предметном стекле определять биохимические свойства микробов. Полисубстратная тест-система и энзимоиндикаторная лента используются для одновременной идентификации 20 биохимических признаков у микробов.

Это новые виды простых долгоживущих препаратов, предназначенных для быстрого и экономичного определения биохимических свойств микробов. Электрофизический метод определения ферментативной активности микробов включает посев микробной культуры на жидкие питательные среды, содержащие пептонную воду, различные углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты с последующим ферментативным расщеплением исследуемых веществ и образованием различных ионизированных продуктов распада, обнаруживаемых специальной электронной аппаратурой.

Результаты энзимоиндикации регистрируются через 45 60 мин с момента посева материала. Метод позволяет обнаружить и идентифицировать конечные продукты распада, то есть конечные мотаболиты с определением их биохимической и химической природы. Безусловно, электрофизический метод заслуживает пристального внимания и нуждается в дальнейшем изучении и доработке. 2. Иммунологическое направление, связанное с быстрым определением как отдельных специфических детерминант, так и с индикацией целых антигенных групп и комплексов, характеризующих роды, виды и серовары бактерий.

К собственно иммунологическому направлению мы относим классические иммунологические методы, основанные на использовании естественных реагентов. Реакции преципитации в жидкости по Асколи и в геле по Оухтерлоню и Манчини особенно их микроварианты сохраняют свое значение как методы экспресс-индикации патогенных микробов и выявления их антигенов в различных материалах. Перспективными являются рапид-системы для одновременной и быстрой индикации различных видов микроорганизмов в реакциях микроагглютинации, хотя по-прежнему не решены вопросы создания оптимальных видов и наиболее экономичных форм таких систем.

Иммунологические принципы распознавания антигенов являются весьма тонкими, специфическими, чувствительными, с большими индикационно-диагностическими возможностями. Комплексирование иммунологических принципов с физическими, химическими и некоторыми другими принципами способствовало дифференциации иммунологического направления на ряд самостоятельных направлений, которые приводятся ниже. 3. Иммунофизическое направление, использующее различные по природе, форме и величине виды мелкодисперсных носителей сорбентов антигенов и антител, способствующих повышению чувствительности комплексных иммунологических методов.

Реакции пассивной гемагглютинации и их модификации связаны с использованием эритроцитарных диагностических препаратов.

Эритроцитарную диагностику с успехом применяются для ускоренного обнаружения и идентификации как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов например, возбудителей туляремии, бруцеллеза, сальмонеллеза и др. в различных патологических материалах, получаемых от больных, и в объектах внешней среды. Реакции с эритроцитарными диагностикумами являются весьма чувствительными, и в этом отношении часто превосходят другие серологические реакции. Они введены в официальные инструкции по экспресс-индикации бактериальных агентов в элементах внешней среды и в материалах, полученных от пораженных людей и животных.

Одновременно продолжаются поиски новых носителей антигенов и антител, которые были бы безантигенными, стабильными, не разрушающимися при длительном хранении, а применяемые реакции простыми по технике постановки например, стекольные тесты и исследования с их помощью экономичными. Совершенствуются реакции с применением цветных целлюлозных частиц в качестве носителей антигенов и антител.

Положительными свойствами такого рода препаратов являются 1 отсутствие собственной антигенности 2 стабильность при длительном хранении 3 демонстративность и простота техники постановки реакции, обычно на предметном стекле 4 высокая скорость прохождения реакции 5 экономичность. Кроме того, полезным и оправданным считаем поиск новых носителей антигенов и антител. В этом отношении перспективными являются ионообменные смолы, латексы, целлюлоза и ее производные и ряд других веществ, которые могут способствовать повышению чувствительности серологических реакций. 4. Иммунохимическое направление, связанное с использованием разнообразных комплексных соединений специфических антител или антигенов с химическими веществами.

Присоединенные химические вещества придают им новые феноменологические способности и свойства, тем самым, расширяя возможности экспресс-индикации микробных агентов в частности и лабораторного анализа вообще. Большую популярность и практическую значимость приобрели методы быстрого иммунофлуоресцентного анализа прямой, непрямой, антикомплементарный, которые ныне официально используются как методы экспрессной индикации и быстрого определения микроорганизмов.

Дальнейшее развитие весьма перспективного иммунохимического направления во многом зависит от химиков, которые должны разработать достаточно яркие новые красители, вступающие в соединения со специфическими антителами и антигенами. В результате могут быть получены препараты с новыми феноменологическими свойствами, позволяющими проводить экспресс-индикацию микробных культур и отдельных клеток с помощью широко распространенных микроскопических устройств типа МБИ различных марок. 5. Иммуноферментное направление, интенсивно развивающееся в последние годы. Разработаны прямой, непрямой, антикомплементарный и другие методы быстрого обнаружения микробов путем использования иммуноэнзимологического принципа предложены новые виды ферментов, а также разнообразные виды хромогенных субстратов.

Данное направление является весьма перспективным, развитие его может привести в ближайшие годы к появлению новых методов экспресс-индикации микроорганизмов. 6. Иммуноэлектрофоретическое направление успешно развивается с конца 50-х годов.

Разработаны многочисленные методы иммуноэлектрофореза. Однако для целей экспресс-индикации микробов чаще прибегают к встречному иммуноэлектрофорезу. Применение новых химических красителей, ферментной или радиоактивной метки позволит резко повысить чувствительность метода иммуноэлектропреципитации. 7. Иммунорадиологическое направление связано с использованием разнообразных конъюгатов специфических антител или антигенов, соединенных с радиоактивными веществами, которые придают им новые феноменологические свойства и способности, расширяя возможности экспресс-индикационного метода. Весьма перспективно дальнейшее развитие иммунорадиологического направления, так как оно несомненно приведет к созданию новых, простых методов экспресс-индикации микроорганизмов. 8. Микроцитологическое направление быстрого цитоморфо-логического анализа связано с использованием светлопольной, фазово-контрастной или люминесцентной микроскопии бактериологических мазковых препаратов, обработанных и окрашенных красителями, позволяющими быстро идентифицировать микроорганизмы по их морфологии и специфическим структурным элементам микробной клетки.

Исследованию подвергают как нативный гной, мокрота, моча, СМЖ, различные экссудаты и др так и обогащенный например, центрифугированием, фильтрованием и другими методами патологический материал. 9. Бактериологическое направление связано с ускоренным выделением и накоплением бактериальных популяций патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов. Оно основано на использовании оптимальных ростовых питательных сред, содержащих необходимые биостимуляторы, для ускоренного получения бактериальной культуры и частичной их идентификации по совокупности культуральных признаков. 10. Фагодиагностическое направление, которое предусматривает, с одной стороны, идентификацию микробов с помощью специфических индикаторных бактериофагов, а с другой, обнаружение и индикацию специфических фагов в патологическом и другом материалах с помощью индикаторных микробных культур. Ускоренная фагодиагностика в ряде случаев является необходимым и полезным методом, позволяющим значительно сократить сроки исследований и установить природу возбудителя даже в тех случаях, когда другими методами, в виду его изменчивости или загрязненности материала, он остается нераспознанным. 11. Биологическое направление, связанное с изучением токсических и агрессивных свойств патогенных микроорганизмов.

Биологические методы осуществляются на одноклеточных организмах, на культурах клеток, куриных эмбрионах, а также на здоровых, а еще лучше специально подготовленных лабораторных животных.

Эти методы более трудоемкие и менее точные по сравнению с другими. 12. Физико-химическое направление.

Это направление связано с использованием сравнительно быстрых, но в то же время и достаточно сложных по аппаратурному оформлению методов.

Сюда входят методы изучения бактериальных популяций и их экстрактов с помощью хроматографии газожидкостная и др спектроскопии инфракрасной, ультрафиолетовой и др резистографии в отношении различных антибиотических, химических и лекарственных веществ, а также методы температурной и кислотной агрегации, коагуляции микробных суспензий и их токсинов. 13. Рецепторное и генетическое направления быстрой индикации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов.

Методы, основанные на этих принципах, только начинают развиваться.

Так, с помощью целлюлозно-глобулинового или эритроцитарно-глобулинового диагностикумов быстро обнаруживают патогенный стафилококк, содержащий белок А, а путем гомологии неизвестных нуклеиновых кислот с известными нуклеиновыми кислотами устанавливают вид патогена. 14. Комплексное направление ускоренной идентификации патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов, использующее методы экспресс-индикации, основанные на интеграции различных принципов, связано с разработкой и созданием индикаторных тест-систем, позволяющих в течение короткого срока и с минимальными затратами на анализ определить комплекс основных признаков патогена или санитарно-показательного представителя, достаточных для его идентификации до рода, вида и даже типа. 15. Направления, связанные с разработкой новых принципов микробиологического анализа.

Вполне вероятно, и мы вправе ожидать в ближайшие 5 10 лет появления новых идей, подходов и принципов в микробиологической науке и смежных с ней областях. Открытие новых видов рецепторной, иммунологической и генетической специфичности у микробов позволит создать новые и возможно более совершенные методы быстрой идентификации микроорганизмов.

Основные пути развития экспресс-индикации микроорганизмов на ближайшие годы 1 создание и конструирование новых препаратов, способствующих ускорению и удешевлению исследований, повышению эффективности лабораторной диагностики инфекций и индикации патогенных и других микроорганизмов. На этом пути предстоит сделать очень многое, поскольку общепринятые диагностические препараты в значительной степени исчерпали свои потенциальные возможности 2 разработка новых более чувствительных, простых методов лабораторного анализа. 3 разработка комплексных методов и видов исследований.

Будет продолжаться дальнейшая интеграция методов и видов исследований, имеющих разные принципы действия, лежащие в их основе 4 создание новых схем исследований. Поскольку лабораторная диагностика инфекционных болезней, а также экспресс-индикация, хотя и в меньшей степени, связаны с изучением комплекса различных свойств и особенностей микроорганизмов с использованием обычно разнообразных методов и приемов, основанных на различных принципах, то создание новых схем исследований с применением новых методов является объективной реальностью и важной задачей, вытекающей из существа самого процесса развития микробиологического анализа 5 разработка и создание новых методов регистрации и учета результатов экспресс-индикационных и лабораторных исследований. 6 разработка новой микроминиатюрной лабораторной посуды, аппаратуры и приборов для исследований 7 автоматизация и компьютеризация исследований.

В современных условиях эти вопросы должны решаться комплексно.

Таким образом, рассмотренные основные направления и пути развития экспресс-индикации микроорганизмов в период современного научно-технического прогресса естественных наук безусловно получат дальнейшее ускоренное развитие, а микробиологическая лабораторная практика обогатится новыми быстрыми методами индикации микробов.